貨號: YJ2273 規格：25管/24樣
線粒體復合體Ⅳ試劑盒說明書
可見分光光度法
產品內容：
試劑一：25mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑二：5mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑三：0.5 mL×1 瓶，-20℃保存；
試劑四：液體10mL×2 瓶，4℃保存；
試劑五：粉劑×2 支，-20℃保存；
試劑六：粉劑×2 支，-20℃保存；
產品說明：
線粒體復合體Ⅳ又稱細胞色素C 氧化酶，也是線粒體呼吸電子傳遞鏈主路和支路的共有成分，負責催化還原型細胞色素C 的氧化，并終把電子傳遞給氧，生成水。還原型細胞色素C 在550nm 有特征光吸收，線粒體復合體Ⅳ催化還原型細胞色素C 生成氧化型細胞色素C，因此550nm 光吸收下降速率能夠反映線粒體復合體Ⅳ酶活性。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。
操作步驟：
正式實驗前務必取2-3個預期差異較大的樣本做與測定。
一、樣本的前處理：
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
- 準確稱取0.1g 組織或收集500萬細菌或細胞，加入1mL試劑一和10uL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
- 將勻漿600g，4℃離心5min。
- 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11100g，4℃離心10min。
- 上清液即為除去線粒體的胞漿蛋白，可用于測定從線粒體泄漏的復合體Ⅳ（此步可選做）。
- 步驟④中的沉淀即為線粒體，加入200uL試劑二和2uL試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10秒，重復30次），用于復合體Ⅳ酶活性測定。
二、測定步驟：
- 分光光度計預熱30min以上，調節波長至550nm，蒸餾水調零。
- 樣本測定
- 工作液的配制：臨用前取試劑四、試劑五、試劑六各一支，將試劑五和試劑六依次轉移到試劑四中混合溶解。分批配制工作液是為了防止當天不能測完，導致工作液失效。
- 將工作液置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min；用不完的試劑4℃可保存一周；
- 在1mL 玻璃比色皿中加入40μL 樣本和800μL 工作液，立即混勻，記錄550nm 處初始吸光值A1 和 1min 后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2。
注意：若ΔA 大于0.2，需將樣本用試劑二稀釋適當倍數（計算公式中乘以相應稀釋倍數），使A1-A2 小于0.2，可提高檢測靈敏度。
三、復合體Ⅳ活力單位的計算：
- 按樣本蛋白濃度計算
單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化降解1 nmol 還原型細胞色素C 定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅳ活力(U/mg prot)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1099×ΔA÷Cpr
此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
- 按樣本鮮重計算
單位的定義：每g 組織每分鐘催化降解1nmol 還原型細胞色素C 定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅳ活力(U/g 鮮重)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=222×ΔA÷W
- 按細菌或細胞密度計算
單位的定義：每1 萬個細菌或細胞每分鐘催化降解1nmol 還原型細胞色素C 定義為一個酶活力單位。
復合體Ⅳ活力(U/104 cell)=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.444×ΔA
V 反總：反應體系總體積，8.4×10-4 L；ε：細胞色素C 摩爾消光系數，1.91×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.04 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500 萬。
