游離脂肪酸（FFA）含量檢測試劑盒說明書
可見分光光度法
注意：正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。
規格：50T/48S
產品內容：
提取液：液體 50 mL×1 瓶，室溫保存。
試劑一：自備。實驗前一天，取一個玻璃瓶，按照正庚烷：無水甲醇：氯仿=24:1:25 的比例配置（自備），蓋緊后混勻，室溫保存。
試劑二：液體 16 mL×1 瓶，室溫保存。
試劑三：粉劑×2 瓶，4℃保存。臨用前每瓶加入 32mL 無水乙醇充分溶解，4℃可保存一周。標準品：粉劑×1 支，10mg 棕櫚酸，室溫保存。臨用前把試劑轉移到 10 mL 玻璃瓶中，加入
7.8 mL 氯仿充分溶解，即為 5μmol/mL 的棕櫚酸標準溶液。
產品說明：
FFA 既是脂肪水解的產物，又是脂肪合成的底物。血清中 FFA 的濃度與脂類代謝、糖代謝、內分泌功能有關。
FFA 與銅離子結合形成脂肪酸銅鹽，并溶于氯仿；利用銅試劑法測定銅離子含量，即可推算出游離脂肪酸含量。
自備儀器和用品：
研缽、冰、臺式離心機、可見分光光度計、1mL 玻璃比色皿、可調式移液槍、一個 40mL 玻璃瓶、一個 10 mL 玻璃瓶、正庚烷、無水甲醇、氯仿（三氯甲烷）、無水乙醇和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣品中 FFA 提取：
1、血清中FFA 測定：將所取血液，室溫靜置 1 h 后，于 4 ℃離心機 3500 rpm 離心 15min，取上層血清置于-20℃冰箱保存，待測。
2、組織中 FFA 含量測定：組織用生理鹽水沖洗干凈后，用吸水紙吸取表面水分，稱取約 0.1g，加入 1.0 mL 提取液，勻漿后，8000rpm，4℃離心 10min，取上清液，待測。
二、測定：
1.分光光度計預熱 30 min 以上，調節波長到 550 nm，無水乙醇調零。
2.試劑二在 37℃水浴中預熱 30 min 以上。
3.標準品的稀釋：將標準品用氯仿稀釋成 1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05μmol/mL。
4.按下表在 1.5mL 離心管中加入相應試劑
對照管測定管空白管標準管
蒸餾水（μL）50
樣本（μL）50
氯仿（μL）50
標準品（μL）50
試劑一（μL）500
試劑二（μL）200
充分振蕩 10min 后，3000rpm，離心 10min
上層溶液（μL）200
試劑三（μL）800
充分振蕩 2min 后，靜置 15min，于 550 nm 下測吸光值，分別記為 A 對照管、A 測定管、A 空白管、A 標準管。（對照管和空白管各只做一管）
三、FFA 含量計算：
1.標準曲線的繪制：
以標準溶液的濃度為 x 軸，以ΔA 標準（ΔA=A 標準管-A 空白管）為 y 軸，繪制標準曲線，得到方程 y=kx+b。將ΔA（ΔA=A 測定管-A 對照管）帶入方程得到 x。
2.血清中 FFA 含量計算
FFA（μmol/L）=1000x
3.組織中 FFA 含量計算
（1）按樣本蛋白濃度計算
FFA 含量（μmol/mg prot）=x×V 樣總÷（Cpr×V 樣總）=x÷Cpr
（2）按樣本鮮重計算
FFA（μmol/g 鮮重）=x×V 樣總÷W
V 樣總：上清液總體積，1 mL；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣品鮮重，g。1000：單位換算系數，1L=1000mL。
注意事項：
(1)試劑三配制應盡量晚配，可在操作到加入試劑二時，再配制試劑三。
(2)必須保證每管的震蕩頻率及時間一致。
(3)盡量在 30min 內完成測量，并且測完后要密封好再丟棄。
(4)因所用試劑多數為有機溶劑，同一支吸頭多次吸取會造成體積不準確，建議更換吸頭。
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