β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase, β-GC）試劑盒說明書 |
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β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase, β-GC）試劑盒說明書 微量法正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定 測定意義： β-GC（EC 3.2.1.21）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，催化β-糖苷鍵水解， 具有多方面生理作用：在纖維素的糖化作用中，β-GC 負(fù)責(zé)進(jìn)一步水解纖維素二糖和纖維素寡糖生成葡萄糖；β-GC 水解萜烯類香氣前驅(qū)體，使糖苷鍵合態(tài)變成游離態(tài)。從而產(chǎn)生香味； β-GC 能夠水解植物體內(nèi)野黑櫻苷，釋放 HCN，從而防止昆蟲取食。 測定原理： β-GC 分解對-硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷生成對-硝基苯酚，后者在 400nm 有大吸收峰， 通過測定吸光值升高速率來計(jì)算β-GC 活性。 自備用品： 可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水 試劑組成和配制： 提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存。 試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 12mL 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。 試劑二：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。試劑三：液體 15mL×1 瓶，4℃保存。 粗酶液提取： 1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織， 加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。 測定步驟 1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 400nm，蒸餾水調(diào)零。 2、加樣表
充分混勻，室溫靜置 2min 后，400nm 處測定吸光值 A，計(jì)算 ΔA=A 測定管-A 對照管。每個(gè)測定管需設(shè)一個(gè)對照管。 β-GC 活力計(jì)算： a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為 y=0.32x-0.0027；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y 為吸光值。 （1）按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位的定義：每 mg 組織蛋白每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。 β-GC 活力(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027) ÷0.32×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T =62.5×(ΔA+0.0027)÷Cpr 需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。 （2）按樣本鮮重計(jì)算： 單位的定義：每 g 組織每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。 β-GC 活力(nmol/h/g 鮮重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.32×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T =62.5×(ΔA+0.0027) ÷W （3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。 β-GC 活力(nmol/h/104cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.32×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T =0.125×(ΔA +0.0027) Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.03mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)， 500 萬；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h。 b.用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為 y=0.16x-0.0027；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/mL），y 為吸光值。 （1）按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位的定義：每 mg 組織蛋白每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。 β-GC 活力(nmol/h/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.16×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T =125×(ΔA+0.0027)÷Cpr 需要另外測定，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。 （2）按樣本鮮重計(jì)算： 單位的定義：每 g 組織每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。 β-GC 活力(nmol/h/g 鮮重)＝[(ΔA+0.0027)÷0.16×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T =125×(ΔA+0.0027) ÷W （3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算： 單位的定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位。 β-GC 活力(nmol/h/104cell)=[(ΔA+0.0027) ÷0.16×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T =0.25×(ΔA +0.0027)
Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.3mL；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.03mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)， 500 萬；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h。 |
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